分析方法转移的仪器系统考量与探讨

转自：药事纵横

分析方法转移是制药行业中常见的技术转移，常见的情形有在分析研发实验室间的转移；研发实验室与QC实验室间的转移；样品生产地点变更时，QC实验室间的转移。药物研发早期，对分析方法转移的法规要求不高；在研发后期或者商业化阶段，方法在QC实验室之间的转移，对定性与定量结果的一致性有较高要求。任何结果的偏离要非常小心，否则易产生超限或超趋（OOX）的结果。方法转移前，如果方法验证与耐用性的研究比较充分，对方法的认知比较了解，方法转移时出现检验结果偏移时会能有足够的信息与手段来应对与解决。

方法转移考察的参数早期通常有精密度与系统适用性数据对比；后期通常会有精密度、准确度和系统适用性等数据对比。精密度和准确度的数据测试，与方法条件与参数设置相关，也与不同实验室仪器系统密切相关。

(资料图片仅供参考)

本文试着从色谱方法自身、色谱仪器系统部分和仪器系统差异性等内容讨论方法转移的一些常见色谱仪系统的考量与挑战。

1.分析方法条件

一个有效成功的分析方法转移，首先是方法自身处于可控状态，方法有可控的条件与参数，包括一些操作注意事项。表1是液相色谱方法常见的条件与参数：

表1液相色谱方法常见条件

序号

条件（或参数）

1

仪器系统

2

试剂

3

样品

4

对照品

5

样品/对照品配制

6

系统适用性溶液配制

7

方法参数、包括进样量、检测波长和梯度条件等

8

进样序列

9

系统适用性要求

10

定性或定量计算方式

11

样品溶性稳定性情况

12

注意事项

方法转移要考虑的元素有方法程序、样品配制、化学试剂、样品配制、其它的设备附件、色谱柱、流动相，以及色谱仪系统。分析方法操作人员也是一个关键元素，因为方法的知识交流与传递非常重要。一个有经验的分析人员，对于方法有相当的了解，哪些地方需要特别注意，哪些地方是方法运行的关键。在与接收方实验人员交流与培训时，这些经验知识非常重要。方法文件的撰写需要有经验的分析人员参与，每一个关键操作步骤都有详尽的描述，否则转移后样品配制的操作方式不同，都有可能导致系统适用性结果不同。样品配制用的化学试剂尽量用同一纯度或同一厂家。样品配制设备，如pH计、吸液枪/管、天平等，需要有实验室可靠的校验方可使用。

进行方法转移时需要根据药物的研发阶段和方法的需求进行适当的风险评估，如图1。色谱仪系统、流动相、样品处理和色谱柱是影响方法使用和转移的主要因素。

图1:色谱分析方法风险评估分析元素

色谱柱是实验室间方法转移差异性的关键原因。色谱柱是分析方法的核心元素，它直接影响到系统适用性结果。方法转移如能严格要求采用同一厂家同一型号的色谱柱，可以很大程度减少色谱柱对于方法的影响。常用的C18､C8等硅烷色谱柱，大厂家大品牌的技术很成熟，批次与批次间的差异性很小。同一厂家同一型号的新老色谱柱由于使用时间不同，柱效会有差异，这是不同实验室间柱效不同的主要原因，因此方法转移时尽量使用新的色谱柱，减少柱效对方法的影响。在方法转移前，如有色谱柱耐用性的研究考察，将减少方法转移的技术困难。

流动相的制备也是方法转移差异性的主要原因。流动相组成包括水、有机溶剂、缓冲盐或酸碱添加剂。水与有机溶剂的化学纯度影响色谱图的基线波动与噪音，缓冲盐与酸碱添加剂的化学纯度是色谱图中出现鬼峰的主要因素。流动相的新鲜制备、pH值的稳定性和微生物的滤除会减少色谱图中杂质峰的出现，从而确保前后色谱图的一致性。

流动相的不同制备方式会导致方法的差异性。比如制备一个50/50的甲醇/水的混合溶剂有四种方式：①先加入500ml的水至1000ml的容量瓶中，用甲醇稀释至1000ml;②先加入500ml的甲醇至1000ml的容量瓶中，用水稀释至1000ml;③分别使用量筒量取500ml的水与甲醇混合；④分别称量500g的水与甲醇混合。由于水与甲醇混合时会有放热的情况，水与甲醇的密度不同，因此这四种方式制备得到的混合溶剂实际组成是有一些差别的。这种差别会导致它作为洗脱剂时洗脱能力不同，从而导致色谱峰的保留差异。

因此在方法文件中要尽可能描述清楚流动相的配制过程、样品的配制过程和系统适用性溶液的配制过程。双方实验室严格按照方法程序的要求进行操作，会减少由于操作本身而导致的差异。

流动相的配制过程客观上会存在一些差异，因此在方法程序上可以设计成色谱系统的多项混合洗脱，使用泵系统进行流动相混合，减少人工配制导致的比例差异。

不同实验室的色谱仪系统客观上会存在一些差异，在方法转移前如能有方法耐用性的研究数据支持，或者参考USP<621>通则，适当调整方法参数，减少这些差别和满足方法系统适用性的要求。

2.色谱仪系统的差别

色谱仪系统是方法转移的重要影响因素，也是导致方法不一致的主要原因。色谱仪是由多个模块组成，不同模块有不同型号，实验室间的色谱仪器客观上很难保持完全一致，这种差异会导致方法转移后的差别。方法的使用寿命有时也长于色谱系统，仪器的更新速度也会增加方法一致性的难度。

色谱系统液体流动路径会影响化合物的保留。这个路径包括系统管线、进样器和流动相混合器。管线按内径分有0.030’’、0.020’’、0.010’’、0.007’’、0.005’’、0.0025’’等类型，一般来说，管线内径的大小对系统的体积影响不大，但内径不同的管线耐压能力不同，压力与流速相关。所以方法的流速与系统的最大耐压会决定选择哪种管线。进样体积会影响峰形与分离度。极端的进样体积，如50uL，峰形会变宽、对称性变差，这是因为样品在管路中心和壁处的层流速度不同，从而导致化合物被扩散。

色谱的泵系统或者溶剂传递系统是方法运行的关键因素。常见的有低压四元混合单泵和高压二元混合双泵。等度方法相对简单，受泵的影响较小。梯度方法较为复杂，流动相在系统中的比例受到泵工作原理的直接影响。低压混合系统中流动相各种组分在到达泵之前就混合完成；高压混合系统中每种溶剂通过专门的泵输送至混合器中，流动相各溶剂比例通过各泵的相对流速来控制。同品牌色谱仪同型号的泵在不同实验室间基本可以做到重复；不同品牌色谱仪，泵的型号不同，对于梯度方法转移会带来挑战。

色谱仪延迟体积的大小会影响色谱峰保留。延迟体积是从流动相混合器到柱前入口处的流路体积。延迟体积一般在供应商提供的资料中可以查到，也可以通过实验测试得到，即用两通代替色谱柱，使用有吸收的物质，设定梯度条件，观察到的梯度中点与设置的程序梯度中点，两间的差值为梯度延迟时间，乘以流速即为系统的延迟体积。如图2.

图2:系统延迟体积测试，梯度程序中两通代替色谱柱

延迟体积受流路内径的影响较小，主要受到色谱仪混合器体积的影响。混合器存在不同体积大小的产品，体积大，梯度的延迟效应明显，复杂的样品分离会影响较大。

混合器体积会影响系统和色谱柱的平衡时间，还有方法回到初始梯度的时间。这些影响在进行方法转移时，实验分析人员需要考虑。

前面提到泵的工作原理，有低压与高压混合两种。在运行梯度方法时，它们的原理是不同的。低压混合模式是各溶剂通过比例阀和在线混合器，溶剂按比例混合，然后通过单泵的高压传输到系统。高压混合模式是流动相通过各自的高压泵，按流速来控制比例，然后在线混合输出到管路中。在低压混合系统中，柱活塞与泵头之间有一定的空间，使得混合溶剂无法全体积输出至管路中，这部分液体将会对系统体积的大小产生影响，从而增加梯度的延迟时间。

3.如何保持不同实验室的色谱仪系统一致性？

方法转移的目标是要在双方实验室得到等效的分析结果。如前所述，如果不同实验室色谱仪系统是相同的，理论上结果应是一致的。客观上不同实验室间的设备会存在差异，比如色谱仪厂家、泵的类型、管线大小、进样器、柱温箱和检测器等，还有分析人员的经验，实验室的环境，都可能存在差异性，从而影响方法转移的等效性结果。

色谱仪溶剂递送系统是关键的影响因素，它影响着系统的延迟体积，最终会影响梯度保留时间。对于这种影响，有三种解决方式。

一是接收实验室的梯度程序与初始系统的梯度程序准确地进行调整，使得各峰的保留时间保持一致。这种方式在实际操作中比较复杂的，依赖于方法本身和分析物的复杂性。也可参考USP<621>通则中的相关指南进行操作，但实施起来仍有困难。

二是通过物理性的增加或减少系统延迟体积，以匹配初始系统的延迟体积，如图3。这种方式的本质是增加或减少混合器的体积或数量，从而调整系统的体积。该方式比较容易操作与实现。

图3:改变混合器，调整系统延迟体积

三是调整进样的时间程序，从而调整方法梯度开始时间。通过在进样程序中设置进样的时间，从而达到梯度开始后，进样仍然可以延缓一段时间后开始，该操作类同于增加了一部分系统体积，从而增加了保留时间。如图4,它是整体增加或减少系统的体积，所以相当于整个延迟或加速方法梯度的间隔。

图4:调整梯度开始时间以匹配系统延迟体积

进样系统在当前分析实验室中基本实现了全部自动化。即由计算机程序控制，不同实验室间的差异很小。不同品牌供应商的进样原理可能不同，大部分是定量环加六通阀，加上洗针程序基本可以消除样品残留的影响，所以不同实验室进样系统对方法的转移影响较小。

柱温对于分析方法是一个重要参数，柱温的控制对方法转移非常重要，它影响色谱峰保留与选择性。通常同品牌的柱温控制箱原理是一样的，不同品牌的柱温控制箱会存在差异，它们都有各自的专利保护。柱温控制箱主要包括温度传感器、加热元件、隔热材料、漏液检测、空气循环、进风和出风系统、溶剂预热等组件。这些组成部分，溶剂预热会影响色谱峰的保留与选择性，如图5。因此不同品牌的色谱仪，要关注柱温箱的控制设置，尽量保持一致的参数设置，减少柱温对方法的影响。

图5:方法转移时的流动相预热

检测器也是影响方法转移的一个因素，商品化常用的紫外检测器有单波长的UV或者全波和的PDA检测器。方法转移时检测器带宽或分辨率设置尽量保持一致，时间常量或滤波器保持一致。不同品牌检测器的流通池会不一样，流通池的体积会影响色谱峰峰宽，从而影响色谱峰峰高。选择同体积的流动池，会减小对色谱峰的影响。

小结

本文主要以色谱方法为例，讨论了方法转移时需要关注的一些情况。方法与化合物的自身复杂性特点会影响方法转移的难度，同时讨论了色谱仪硬件系统在方法转移时的影响以及常见的解决方式。

参考文献：

1.InstrumentConsiderationsintheTransferofChromatographicMethods,PartI:MethodConsiderations，LCGCNorthAmerica,2018,Volume36,Issue9,Pages:693–696.

2.InstrumentConsiderationsintheTransferofChromatographicMethods,PartII:SystemConsiderations，LCGCNorthAmerica,2018,Volume36,Issue11,P824-829.

3.InstrumentConsiderationsintheTransferofChromatographicMethods,PartIII:AligningPerformanceofModules，LCGCNorthAmerica,2019,Volume37,Issue3,P185–191

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